我公司本月的五周年*活動(dòng)即將結(jié)束啦，要說時(shí)間真是太快了，我公司成立的這五年來，酶聯(lián)免疫試劑盒已經(jīng)得到了多大科研機(jī)構(gòu)的認(rèn)可，同時(shí)也非常感謝支持，今天恒遠(yuǎn)介紹采用酶聯(lián)免疫法判別鑒定抗原結(jié)合性抗體。
    當(dāng)用純化抗原進(jìn)行選擇時(shí)，評(píng)價(jià)所選擇抗體的*方法是在高通量滴定模式下進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。雖然這也許與抗體zui終使用無關(guān)，但它提供了一個(gè)起始的篩選實(shí)驗(yàn)方案，能夠讓續(xù)后的分析集中在有希望的抗體上。大多數(shù)噬菌粒展示載體的設(shè)計(jì)容許進(jìn)行兩種ELISA模式：一種是噬菌體ELISA，即用標(biāo)記的抗噬菌體二抗試劑檢測(cè)已結(jié)合的噬菌體。
    另一種是可溶性scFv ELISA，即借助附在N端或C端上的表位標(biāo)簽來檢測(cè)可溶性scFv。在這兩種情況下，抗體表達(dá)都由lacZ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。噬菌體展示取決于缺失葡萄糖時(shí)的滲漏表達(dá)，同時(shí)為了誘導(dǎo)可溶性抗體片段的表達(dá)，也需要使用IPTG。
    曾用來進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)簽包括：9E10、SV5以及FLAG?？傮w上，盡管我們也發(fā)現(xiàn)一些抗體在噬菌體模式可以有信號(hào)，而在可溶性模式下卻消失，但兩種ELISA模式的結(jié)果是類似的。這也許是抗體發(fā)生了框移所致。當(dāng)這些抗體展示在噬菌體表面時(shí)，會(huì)有大量的scFv被檢測(cè)到；而當(dāng)表達(dá)為可溶性scFv時(shí)則不行。這種情況正如前面在肽文庫所描述的那樣。大多數(shù)目前所使用的噬菌粒載體都容許從噬菌體結(jié)合性scFv簡(jiǎn)單切換到可溶性scFv。這要通過包括1個(gè)位于scFv基因和gⅢ之間的可抑制性琥珀密碼子(TAG)來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)非抑制株中，琥珀密碼子被讀作為終止子，因此，只有可溶性scFv。在一個(gè)非抑制株中，TAG密碼子讀作谷氨酰胺以及終止密碼子，可溶性scFv和scFv—pⅢ融合蛋白都將。也許理想的情況是，通過感染抑制株進(jìn)行由噬菌體結(jié)合性scFv到可溶性scFv的轉(zhuǎn)換，但實(shí)際上這并不必要。可溶性scFv的表達(dá)在抑制株內(nèi)是很容易完成的，因此，抑制通常不過50％。粗制噬菌體或scFv樣品就可適合于大多數(shù)的預(yù)分析試驗(yàn)。然而，如能簡(jiǎn)單地進(jìn)行抗體純化對(duì)于后續(xù)分析是有利的。是用包含六組氨酸標(biāo)簽的噬菌體載體，或者是將scFv基因亞克隆到一個(gè)將六組氨酸標(biāo)簽融合到scFvC末端的載體中。
    不同輪次選擇中，陽性克隆的比例將取決于抗體文庫質(zhì)量、抗原性質(zhì)和物理選擇過程，包括抗原密度、是否用可溶性或固相抗原以及洗滌嚴(yán)謹(jǐn)性。我們發(fā)現(xiàn)：按照免疫管選擇程序，在第二輪后一般有10％～100％的克隆是陽性的。盡早評(píng)估多樣性，因?yàn)殡S著選擇的進(jìn)行，多樣性會(huì)降低。這樣就能提供一個(gè)更大容量的抗體文庫，便于從中選擇合適的抗體。
    盡管結(jié)合性篩選方法是有用的，但這些常不將此法用于zui終的抗體選擇。能夠相對(duì)快速地大量抗體，可以容許建立一些除結(jié)合性方法之外的篩選方法。用于細(xì)胞內(nèi)化、受體活化、配體拮抗、病毒滅活、誘導(dǎo)或抑制凋亡的各種選擇方法，均可預(yù)期。而且，在某些情況下，例如內(nèi)化，甚或可能直接選擇具備這些功能的抗體。
    采用ELISA時(shí)，噬菌體抗體可以在96孔微量滴定板中制備。將單個(gè)克隆挑人板孔中、培養(yǎng)并作為噬菌粒用輔助噬菌體進(jìn)行救援。在微量板模式下噬菌體的生產(chǎn)效率不及更大體積的培養(yǎng)。這是因?yàn)椴煌寺〉纳L(zhǎng)率差異過大，結(jié)果有些克隆感染輔助噬菌體是在*OD值時(shí)，而其他克隆卻是在OD值過高或過低時(shí)感染。這就導(dǎo)致了不同孔中噬菌體滴度差異很大。
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