一、ELISA基本原理

ELISA通過抗原-抗體的特異性結合，利用酶催化底物顯色反應進行定量或定性分析。常見的類型包括直接法、夾心法和競爭法，但其核心步驟均依賴于以下三類關鍵試劑。

二、核心試劑一：包被抗體/抗原——實驗的“基石"

作用：作為固相載體（微孔板）的固定化分子，捕獲目標物。

純度與活性：高純度避免交叉反應，確保結合效率（建議使用單克隆抗體）。

包被濃度優化：預實驗確定最佳濃度（通常1-10 μg/mL），濃度過高易導致空間位阻。

緩沖液選擇：碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）常用，避免含BSA或Tween的溶液。

常見問題：

非特異性結合：增加封閉步驟（如5%脫脂牛奶或BSA封閉1小時）。

包被不均：4℃過夜包被優于室溫2小時，提高結合穩定性。

三、核心試劑二：酶標抗體——信號的“放大器"

作用：與目標物結合后催化底物顯色，將生物學信號轉化為光學信號。

酶的種類：

HRP（辣根過氧化物酶）：常用，底物為TMB（顯藍色）或OPD（顯黃色），靈敏度高。

AP（堿性磷酸酶）：底物為pNPP（顯黃色），適用于磷酸鹽緩沖體系。

標記效價：高效價減少用量，降低成本（建議效價≥1:5000）。

保存條件：HRP需避光保存，避免反復凍融（分裝后-20℃儲存）。

注意事項：

避免與疊氮鈉（HRP抑制劑）共用，可選擇ProClin 300作為防腐劑。

四、核心試劑三：底物顯色系統——結果的“可視化"

作用：酶催化底物生成有色產物，通過吸光度值定量目標物濃度。

常用底物對比：

優化技巧：

顯色時間控制：室溫避光反應10-30分鐘，避免過度顯色導致背景升高。

終止時機：當標準品最高濃度孔顯色明顯時立即終止。

五、實驗流程關鍵步驟

包被：100μL/孔，4℃過夜。

封閉：含1% BSA的PBS，37℃1小時。

加樣：樣本梯度稀釋，37℃孵育1小時。

酶標抗體孵育：37℃1小時，洗滌3次（0.05% Tween-20 PBS）。

顯色與終止：TMB顯色15分鐘，2M H?SO?終止。

讀數：雙波長檢測（450 nm/630 nm校正孔間誤差）。

六、常見問題與解決方案?

高背景噪音?：增加洗滌次數（5次以上），檢查封閉液是否失效。

低信號值?：優化包被濃度或延長底物孵育時間。

孔間差異大?：使用多通道移液器，確保加樣一致性。